浙江农林大学朱斐教授、许英蕾教授莅临康德权分享《WSSV亚单位疫苗的免疫效果》课题研究进展

科学技术是第一生产力。康德权企业作为国家高新技术企业，不仅专注于企业自身包膜技术的研发创新，同时也积极与科研院所、高校合作，针对行业热点问题进行课题研究。

白斑综合症病毒(whitespotsyndromevirus,WSSV)是危害我国甲壳类动物养殖的最大生物源因素，该病毒引起的白斑综合症被中国农业农村部列为一类动物疫病，是水生动物仅有的两种动物一类疫病之一。为解决此问题，推动水产养殖健康发展，康德权企业全力经费支持浙江农林大学朱斐教授、许英蕾教授研究团队对《WSSV亚单位疫苗的免疫效果》课题进行深度研究。

目前，此课题研究已取得阶段性进展，发表了一篇题为《WSSVproteinsandDNAgenomereleasedbyultrasonicrupturecaninfectcrayfishaseffectivelyasintactvirions》的SCI文章，以下是对文章部分内容的简要解析与分享。

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摘要

超声波破碎白斑综合症病毒(WSSV)的蛋白质和核酸可以同完整的WSSV病毒粒子一样感染小龙虾，并致其死亡。本研究中，利用超声波破碎病毒，通过50nm的滤膜过滤得到过滤液。经PCR和SDS-PAGE分析表明，过滤液中同时存在病毒基因(VP19、VP26、VP28和DNA聚合酶)和蛋白质(VP15、VP19、VP26和VP28)。电镜观察发现，过滤的溶液中没有完整的病毒粒子。当小龙虾被注射过滤液或注射完整的WSSV时，其死亡率均为%，同样，口服过滤液和完整WSSV的小龙虾死亡率也为%。经超声波破碎的病毒过滤液含有病毒蛋白和残留的DNA基因组，因此可以像完整的病毒粒子一样有效感染宿主。将病毒蛋白和残留DNA基因组的溶液用DNA酶消化后注入小龙虾体内，存活率为%。我们还发现，虽然DNA酶可以破坏破碎病毒溶液中的病毒蛋白(VP15除外)，但DNA酶不会破坏完整病毒的结构蛋白。在经过DNA酶处理的破碎液中，剩余的病毒蛋白保护DNA基因组免于降解，我们认为这个蛋白是DNA结合蛋白VP15。本研究揭示了超声破碎的病毒蛋白和核酸作为免疫疫苗的危险性，原因是蛋白会保护核酸很难被DNA酶降解，如果使用会导致宿主病毒感染。

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关键词

超声破碎法；病毒蛋白；WSSV；病毒粒子；攻毒；小龙虾；

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结果

3.1口服攻毒小龙虾的生存分析

投喂纯化WSSV和WSSV+U的小龙虾死亡率均为%(图1)，而投喂PBS的阴性对照组小龙虾存活率为%。因此，与纯化的WSSV相比，WSSV超声破碎液的病毒蛋白和基因组是完整的，并保持生物活性，可导致小龙虾死亡。

3.2超声破碎的WSSV的PCR分析

PCR分析证实了WSSV的重要基因(VP19、VP26、VP28和DNA聚合酶)均存在于WSSV超声破碎液中(图2A)。在使用DNA酶处理后，在WSSV超声破碎液中也发现了这些病毒基因(图2B)。在使用DNA酶处理前，用DNA纯化试剂盒从WSSV超声破碎液中去除蛋白质，VP19、VP26和VP28的条带以及DNA聚合酶核酸片段都消失了(图2C)。以上结果表明，WSSV超声破碎液中存在VP19、VP26、VP28和DNA聚合酶4个病毒基因，以及WSSV蛋白，这些病毒蛋白可以保护病毒DNA不被DNA酶消化。

3.3完整的和超声破碎的WSSV的SDS-PAGE图

SDS-PAGE证实了WSSV超声破碎液中存在4种重要的WSSV蛋白VP15、VP19、VP26和VP28(图3A,2)。令人惊讶的是，DNA酶处理后，VP19、VP26和VP28蛋白消失，而VP15蛋白仍然存在于溶液中(图3A,4)。这4条蛋白带均存在于经过DNA酶处理的WSSV病毒粒子中(图3A，3)，为了排除DNA酶消化过程中孵育处理的影响，将WSSV超声破碎液在37℃下孵育30分钟后重复实验。研究发现，孵育处理并不影响病毒蛋白的存在(图3B，3、4)，SDS-PAGE(图3B，1、2)证实了所有重要的WSSV蛋白仍然存在于WSSV破碎液中。而经DNA酶处理后，WSSV超声破碎液中仍然存在VP15蛋白条带(图3A,4)。证实了，DNA酶处理没有破坏完整病毒粒子的蛋白，但破坏了WSSV超声破碎液中的病毒蛋白。

3.4电镜观察WSSV的完整和超声破碎情况

纯化后的WSSV电镜显示相对完整的病毒粒子(图4A)。另一方面，WSSV超声破碎液的电镜显示没有完整的病毒粒子(图4B)，证实了WSSV超声破碎液只含有病毒蛋白和病毒DNA。

3.5攻毒小龙虾中WSSV拷贝数的测定

为了研究破碎病毒的传染性，我们分别用完整的WSSV和超声处理不同时间的病毒攻毒48h，测定WSSV拷贝数。完整的病毒拷贝数(3.00E+05)低于病毒超声破碎处理4h(9.04E+05,P=0.),8h(1.88E+06,P=5.E-05),12h(2.79E+06，P=0.)或15h(8.33E+5,P=0.)(图5)。仅超声处理WSSV1h，病毒拷贝数并没有显著增加。

3.6攻毒小龙虾的生存分析

以攻毒小龙虾的死亡率来测定WSSV在不同处理后的传染性。对照组(PBS)在h内无一例死亡。然而，用经超声处理1h、4h、8h、12h和15h的WSSV注射攻毒h后小龙虾的死亡率均是%(图6)。以DNA酶处理后的病毒破碎液攻毒的小龙虾未发生死亡(图7)。WSSV组的小龙虾在攻毒后72h开始死亡，h后死亡率达到了%。以WSSV破碎液进行攻毒，小龙虾在72h后开始死亡，h达到%死亡(图7)。这些数据表明，超声破碎的WSSV可以感染和致死小龙虾，与纯化的WSSV一样有效。以DNA酶处理后的病毒进行攻毒，小龙虾在72h开始死亡，h全部死亡。此外，破碎病毒在37℃孵育30分钟没有改变小龙虾的死亡率，与WSSV组一样死亡率达到%(图7)。以上结果表明，破碎的病毒蛋白和核酸就能使小龙虾感染死亡，同时DNA酶对完整的WSSV病毒粒子没有作用，但对破碎的病毒粒子有效，使破碎液不具致死性。

3.7用PCR法检测WSSV感染的小龙虾

PCR结果表明，注射WSSV超声破碎液后，死小龙虾和活小龙虾均感染了WSSV(图8，3、4、5、6)。另一方面，PCR检测结果显示，小龙虾注入经DNA酶处理后的超声破碎液后没有任何感染迹象(图8，7、8)。以上结果表明，病毒超声破碎液可以和完整的病毒粒子一样感染小龙虾，但经DNA酶处理后的超声破碎液就不具有感染性了。

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总结

研究证明了超声破碎的病毒蛋白和核酸就能使小龙虾感染WSSV，且死亡率一样高达%，同时还说明了病毒蛋白会保护核酸不被DNA酶破坏，只有超声破碎后的样品加DNA酶才能使小龙虾不感染WSSV，纯病毒粒子加DNA酶一样会使小龙虾感染WSSV，即DNA酶不能穿过核衣壳起作用。而DNA酶处理后会导致重要蛋白的消失，超声破碎后用DNA酶处理虽然没有致病性了，但同时没有重要的蛋白（VP26和VP28等），达不到免疫效果。

文献来源：

YongyongLai;FeiZhu;YingleiXu.WSSVproteinsandDNAgenomereleasedbyultrasonicrupturecaninfectcrayfishaseffectivelyasintactvirions[J].JournalofVirologicalMethods.,():-

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